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【试验】牛樟芝抗肝癌的效应与机制研究

* 来源 : * 作者 : admin * 发表时间 : 2017-08-16 * 浏览 : 13

数据源:鑫大埔

李红玉

南京中医药大学   中医内科学

  全球每年新确诊的恶性肿瘤中约有9.2%为肝癌,在肝癌的新发病例中,亚洲约占70%,其中,我国的肝癌发病率居首位,且我国HCC患者的年死亡人数占全球HCC患者死亡人数的55%左右。那些进展为HCC的患者几乎都在12个月内死亡,证明HCC进展极快且预后极差,因此,急需寻找有效的治疗药物。

  ANCA-E-D是牛樟芝的二氯甲烷提取物。台湾当地居民一直用牛樟芝来治疗食物和药物中毒、腹泻、腹痛、皮肤瘙痒、改善免疫和肝功能等,而现代药理也证实,牛樟芝具有调节免疫、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化和神经保护等作用。

  研究发现,牛樟芝与中药灵芝同属于多孔菌科的真菌,生长习性和性味相近,生物活性成分不同,尤其是牛樟芝的生物活性物质种模拟单一种类的灵芝更多,且萜类和多醣等含量更高,故而近年来,牛樟芝的抗肿瘤和免疫调节等功效成为研究的热点。

  我们认为牛樟芝具有扶正补虚和抗癌解毒的双重功效,是一种潜在的特异性的抗癌中药。已有的研究证实,牛樟芝可以抑制肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的生长。

  本研究中,我们利用SMMC-7721肝癌细胞株,通过体内和体外实验,利用基因芯片高通量的特点,初步探讨牛樟芝对肝癌细胞的体内外抑制作用和分子机制。

方法:

1.体内实验

(1)SMMC-7721细胞(4×105 cell/只)接种至46周龄雄性BABL/c裸鼠右后肢皮下,建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型;

(2)造模成功裸鼠随机分为3组(10/组):生理盐水对照组,25 mg/kg ANCA-E-D实验组、50 mg/kg ANCA-E-D实验组,腹腔注射,每天1次,连续治疗21;

(3)观察裸鼠的一般状况,测量各组裸鼠的体重、移植瘤体积等;血液学检测血清ALTAST含量;病理切片HE染色检测移植瘤和肝肾组织,IHC检测移植瘤组织的MVDPCNA的表达,TUNEL检测移植瘤组织的细胞凋亡。

2.体外实验

(1)020406080 mg/L ANCA-E-D处理SMMC-7721细胞244872hMTT法检测SMMC-7721细胞的增殖抑制率;

(2)0204060 mg/L ANCA-E-D处理SMMC-7721细胞24hHoechst33258及瑞氏染色观察细胞形态;

(3)020406080 mg/L ANCA-E-D处理SMMC-7721细胞24h,流式细胞术(FCM)检测细胞周期和细胞凋亡;

(4)0204060 mg/L ANCA-E-D处理SMMC-7721细胞24h,基因芯片检测差异基因的表达;

结果:

  体内实验:ANCA-E-D可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长,抑制裸鼠移植瘤中微血管的形成以及PCNA的表达,诱导移植瘤细胞的凋亡;ANCA-E-D对移植瘤裸鼠的ALTAST无影响。

  体外实验:2080mg/L剂量之间的ANCA-E-D可显著抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖;Hoechst33258及瑞氏染色发现,ANCA-E-D处理后SMMC-7721细胞出现凋亡形态改变;FCM周期检测发现,ANCA-E-D可在一定程度上影响SMMC-7721细胞周期进程;FCM凋亡检测发现,ANCA-E-D处理后,SMMC-7721细胞凋亡呈浓度依赖性增加。基因芯片检测发现,ANCA-E-D3个剂量组中,共同上调的基因有422个,共同下调的基因有377个。GO功能分析,这些基因涉及细胞信号转导、迁移、粘附、凋亡、分化、代谢、增殖、血管生成、器官发育等多方面。与凋亡相关的4倍以上的差异基因中,ANCA-E-D20 mg/L组筛选6个,40 mg/L组筛选出12个,60 mg/L组筛选出35个。Pathway分析,3个剂量组中的差异基因均参与的信号通路包括TNF signaling pathwayCalcium signalingpathwayPathways in cancerPI3K-Akt signaling pathwayMAPK signaling pathwayJak-STAT signaling pathway Apoptosis等。

结论:

  牛樟芝提取物ANCA-E-D具有体内外抗肝癌作用,其作用机制可能是通过影响EDNRAHRKLCN2ANGPTL4等基因的表达,进而影响包括凋亡在内的诸多信号通路来实现的。