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【试验】牛樟椴木栽培之牛樟芝子实体的大鼠 90 天重复剂量亚慢性毒性评估(上)

* 来源 : * 作者 : admin * 发表时间 : 2017-08-18 * 浏览 : 0

王志源,杨长青,王千眉,蔡庆龙,蔡岳廷

新北市,台湾

检验及品保杂志(J Testing Qual Assur) 2016; 5:  99~110

摘要

  本试验系依据卫生署公告之健康食品安全性评估方法,评估牛樟椴木栽培之牛樟芝子实体萃取物,经连续喂食大鼠90 天后对大鼠体内可能产生之毒性变化进行评估,以作为重复使用安全性的参考。

  本试验共设置4 组试验组,分别为对照组、低、中及高剂量组。低、中及高剂量组试验物质投予剂量分别为50 mg/kg B.W.100 mg/kg B.W.150 mg/kg B.W.,分别为人体每日建议口服剂量(人体每日3060 90mg/60Kg B.W.)之100 倍。每组各使用10 只雄性及雌性Sprague-Dawley (SD) 品系大鼠,以口服管喂方式连续90 天投予试验物质,每日进行试验动物之临床观察,且每周测量试验动物之体重及摄食量。

  试验结束后,牺牲大鼠采集血液及脏器进行血液学分析、血清生化分析及病理学检查。

前言

         1999 年行政院卫生署食字第88037803号公告健康食品安全性评估方法[10]。依此方法,此试验目的系评估试验物质「牛樟芝子实体(牛樟椴木栽培)」经重复给予90 天后对哺乳类动物可能产生之毒性影响,了解毒性变化之产生,同时测定无毒性显示之剂量(noobserved-adverse-effect level, NOAEL)

材料及方法

实验动物及饲养环境

        试验动物为5 周龄之雄性与雌性Sprague–Dawley (SD) 品系大鼠各40 只,共80 只。经由乐斯科生物科技股份有限公司购入,入室后经7 天检疫期以及7 天适应期,试验开始时大鼠为7 周龄。饲养于通过TFDA-GLPOECD-GLP 认证的台美实验动物中心,22±3℃、55±15%相对湿度、12 小时之光暗周期,以及充分提供经灭菌之逆渗透水。

分组与剂量

        大鼠90 天重复剂量亚慢性毒性试验,共使用80 只大鼠,试验物质有低、中及高剂量,加上对照组共4 组,每组雌雄各10 只大鼠。5 周龄之雄性SD大鼠经检疫驯养二星期后至7 周龄时开始进行试验,动物随机分成4 组,每笼两只,并编号打耳洞表示。

        剂量选定,根据试验委托单位所提供数据显示,「牛樟椴木栽培牛樟芝子实体(Fruiting body of Antrodia cinnamomea)」成人每日摄取量为3060 90 mg/60Kg B.W. 大鼠给予剂量分别为50 mg/kg B.W.100 mg/kg B.W.150 mg/kg B.W.,一天一次喂足,为人体每日建议口服剂量之100 倍。详细分组如下表1 所示:

检测项目

        临床症状观察:试验期间每日进行临床观察,并记录投予试验物质后试验大鼠是否显现异常临床症状或死亡情形,所有异常临床症状或死亡情形均须记录于个别动物临床观察纪录表。

        眼睛检查:先以肉眼观察有无外观之异常,再使用检眼镜(Ophthalmoscope) 检查眼睛内部构造。所有动物在试验开始前及试验结束牺牲前一日均须进行眼睛检查。体重与摄食量测定:试验期间每周测量各组大鼠体重1 次。摄食量每周进行结算1次,量测方法为体重称重当日加入定量饲料,一周后结算剩余饲料量。

       尿液分析:于牺牲前一日,将动物置于代谢笼内约16 小时并收集尿液。利用尿液检测分析仪(PU-4010ARKRAY Core Laboratory,日本)分析各组大鼠尿液之比重(specific gravitySG)、颜色(color)、蛋白质(protein)、尿胆素原(urobilinogen)、酸碱值(pH)、酮体(ketone body)、胆红素(bilirubin)、葡萄糖(glucose)、亚硝酸盐(nitrite)及潜血(occult blood)反应。将尿液离心后取尿沉渣以显微镜检查其中所含白血球计数(whiteblood cell countWBC)、红血球计数(redblood cell countRBC)及上皮细胞(epithelialcellEP) 等细胞种类与数目、尿结晶(crystals)种类与数目及微生物数目数目等。

        血液学分析:试验动物于牺牲前经隔夜禁食,以二氧化碳麻醉后经心脏采集血液。血液置于含有EDTA 抗凝剂之收集管中于室温下混合均匀, 以全自动血球分析仪(XE-1800iSysmex,日本)进行以下项目之检测:血球容积比(hematocrit)、血红素量(hemoglobin)、红血球数(RBC)、白血球数(WBC)、血小板数(platelet count)、平均红血球容积(mean corpuscular volumeMCV)、平均红血球血红素(mean corpuscular hemoglobinMCH)、平均红血球血红素浓度(meancorpuscular hemoglobin concentrationMCHC)、淋巴球(lymphocyte)、嗜中性球(neutrophil) 及单核球(monocyte) 、嗜酸性球(eosinophil) 以及嗜碱性球(basophil)此五种白血球百分比。另以含有sodium citrate 抗凝剂之收集管采集血液并以全自动血液凝固分析仪(CA-1500Sysmex,日本)检测凝血酶原时间(prothrombin time)

        血清生化分析:动物经隔夜禁食,以二氧化碳麻醉后经心脏进行血液采样。血液静置于室温待其凝固后,离心分离出血清并以血清生化分析仪(7070 AutoanalyzerHitachi,日本)进行以下项目之检测:碱性磷酸酶(alkaline

phosphataseALP)、麸氨酸氨基转氨酶(aspartate aminotransferaseAST)、麸氨酸丙酸转氨酶(alanine aminotransferaseALT)、丙麸氨转肽酶(Gamma-glutamyl transpeptidase-GT)、白蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、血总蛋白质(total protein)、总胆红素(total bilirubin)、肌酸酐(creatinine)、血中尿素氮(blood urea nitrogenBUN)、葡萄糖(glucose)、胆固醇(cholesterol)、三酸甘油酯(triglyceride)、磷离子(phosphorus)、钙离子(calcium)、氯离子(chloride)、钾离子(potassium)及钠离子(sodium)

        组织病理学检查:试验期间,若有动物死亡均尽快进行解剖检查。试验结束后(试验第91 天)所有存活大鼠,以二氧化碳麻醉后经心脏采血牺牲,并进行解剖,以肉眼检查大鼠外观、口腔、颅腔及胸、腹腔内所有组织及器官,并将检查结果记录于解剖纪录表上。采集各试验组之脑(brain)、心脏(heart)、肾脏(kidney)、肝脏(liver)、脾脏(spleen)、肾上腺(adrenals)、睾丸(testis)或卵巢(ovary)、胸主动脉(aorta)、骨髓(bone marrow)、十二指肠(duodenum)、空肠(jejunum)、回肠(ileum)、盲肠(caecum)、结肠(colon)、直肠(rectum)、眼睛(eyes)、食道(esophagus)、乳腺(mamary gland)、哈氏腺(Harderian gland)、气管(trachea)、肺(lung)、淋巴结(lymphnode)、胰脏(pancreas)、坐骨神经(sciaticnerve)、脑下垂体(pituitary)、前列腺(prostategland)、唾液腺(salivary gland)、皮肤(skin)、脊椎(spinal cord)、胃(stomach)、肌肉(thighmuscle)、胸腺(thymus)、甲状腺/副甲状腺(thyroid/parathyroid gland)、膀胱(urinarybladder)、子宫(uterus)等组织,并将上述组织以10 %中性福尔马林溶液进行固定及保存(各组大鼠睾丸则以modified Davidson’s solution固定24 小时后,再以10%中性福尔马林溶液保存)。取下所有存活大鼠的主要器官:脑、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、肾上腺、睾丸或卵巢,去除外围脂肪组织后分别称重及记录其绝对重量。另计算各脏器与体重(试验第91 天) 之比值(organ weight relativebody weight ratios),即脏器相对重量比率(%)=脏器重量(g)÷体重(g)×100%。组织病理检查主要将所有上述固定好的组织样本经石包埋、切成6~5 m 厚度之薄片,以苏木紫和伊红染色(hematoxylin and eosinstain),并使用光学显微镜观察,分析各脏器之组织病理变化。

资料整理与分析

        实验资料以平均值(mean)及标准偏差(standarddeviation, S.D.)表示。动物之体重、摄食量、脏器重量、血液学分析及血清生化分析等数据,均利用SPSS 统计软件中单因子变异数分析(One-Way ANOVA) Duncan’smultiple range test 分析各组别间资料之差异性,并以p 值小于0.05 作为显著差异水平。