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【学术】牛樟芝滴丸护肝功效实验研究

* 来源 : * 作者 : admin * 发表时间 : 2017-08-31 * 浏览 : 0

 刘典谟  段俊国

成都中医药大学,四川  成都610037

【文章编号】1007-8517 (2012)080055-02

目的

研究台湾特产牛樟芝滴丸的护肝功效。

方法:采用以自动生化分析仪检测肝功能GOTGPT生化指数;抗氧化功能相关产物麸胱甘、麸胱甘过氧化酶、超氧化物歧化酶及蛋白质浓度活性分析,以评估肝功能效价。

结果:血中肝功能生化指数检测结果显示,大白鼠腹腔注射APAP会升高血中GOTGPT指数,肝脏细胞的GSH浓度也会减少,SODGPx的酵素活性也都下降。

牛樟芝滴丸可降低GOTGPT指数,升高GSH浓度;牛樟芝滴丸可回复SODGPx等相关抗氧化酶的酵素活性的表现,对于保护肝脏功能确有帮助。

牛樟芝(Antrodia camphorata)为仅生长在台湾特有的牛樟树上,为台湾珍贵特有的真菌,经常被应用于养生保健上。早期台湾原住民用来治疗因饮酒过度所造成的肝脏病变,被原住民视为珍宝。

20170829

       

    樟芝子实体和一般的食药用蕈菇类一样具有复杂的成分,包括多醣体、三帖类(triterpenoids)、超氧歧化酵素(superoxidedismutase)。这些成分的生理活性功能包括:抗肿瘤、提升免疫能力、抗病毒、抗过敏、抗高血压、抑制血小板凝集、降血醣、降胆固醇、抗细菌及保护肝脏。

    目前对牛樟芝的研究方向以樟芝子实体甲醇萃取物或水萃取物之抗氧化、抗癌、及保护肝脏为主。前期研究采用滴丸制剂改善牛樟芝水不溶性成分吸收研究,本研究将继续探讨其新剂型的护肝功效。

1.方法

11 实验设计

将每组12只以上雄性BALBc小鼠(20-25)分为6组,分别为:

A.正常对照组:生理食盐水(IP) +ddH O(PO)

B.负对照组(肝损伤组)400mg APAPkg bw (I )+ ddI-I20 (P0)

C.正对照组(N-acetylcysteine(NAC)治疗对照组)400mg APAPkg bw (IP) +600mg NACkg bw (PO)

D.牛樟芝滴丸一倍剂量(1x)实验组:400mg APAPkg bw(IP) +牛樟芝滴丸(20颗/kg bw)(PO)

E.牛樟芝滴丸3倍剂量(3X)实验组:400 mg APAPkg bw(IP)+牛樟芝滴丸(60颗/kg bw)(PO)

F.牛樟芝滴丸5倍剂量(5X)实验组:400 mg APAPkg bw(IP)+牛樟芝滴丸(100颗/kg bw) (PO)

12 步骤

        A组腹腔注射生理食盐水(06ml30g bw for mice)B-F组腹腔注射400mg APAPkg bw (06ml30g bw formice),每周两次(星期一及四)于样品灌喂前一小时进行肝炎诱导,减少药物及样品互相影响;并在AB组每日灌胃ddwater,在C组灌喂NAC(600 mSkg bw for mice),在D-F组则分别灌以试验样品,共为期八周。

        所有实验动物每周投予试验样品(ddH 0NAC)4小时,以尾

部采血方式检测肝脏的生化功能:GOT(AST)GPT(ALT)

        最后于第八周结束时全部牺牲,并剖腹取肝脏标本,秤重后将最大右叶肝割取一半固定于l0 的中性福尔马林(formaline)液中,石蜡包封切片后分别作苏木紫一伊红染色(haematoxylin-eosin stainHE stain)来进行病理学观察外,并做胶原蛋白的特殊染色(Masson-strichrome stain),以便评估肝纤维化程度。

        另外将其余肝脏分别进行检测抗氧化成分glutathione(GSH)glutathione peroxidase(GSH Px)glutathione reductase(GSH Rd)glutathi—one Stransferase(GST)superoxide dismutase(SOD)catalase等酵素活性。

        实验资料统计分析采用SAS计算机统计软件包(SASinstituteCaryNC)进行变异数分析(analysis of varianceANOVA),并以Duncan@test来测试不同处理间显著差异效果(P<005)

13 肝功能生化指数的检测

        所有小鼠血液样品在室温下放置一小时以使其凝结。再以冷冻离心机于4~C下每分钟12000 rpm离心5分钟,来分离血清。再以自动生化分析仪检测肝功能生化指数,如GOTGPT等。

14 抗氧化功能相关产物及酵素活性之分析

(1)麸胱甘(GlutathioneGSH)浓度之分析Glutathione浓度的分析系采用Cayman Chemical公司生产的分析试剂组(glutathione assay kit)测定之,其检测方法简述如下。

        取肝组织,以均质液(50 mmol1 MES1 mmolfl EDTA1 mmol1 DTrpH 6-7)均质之,在10000 g4~C下离心15分钟。取上清液以等体积的方式加入1 mol1metaphosphoric acid溶液混合之,于室温下反应5分钟后离心(3000 g2分钟),取上清液加入4 mol1triethanolamine(201vv)混合。取此混合液501xl加入150assay Cocktail(MESreconstituted Cofactor Mixturereconstituted Enzyme Mixturereconstituted DNTB),反应开始后,以plate reader读取每5分钟405 nm波长的吸光值至反应进行至30分时为止,计算GSH之浓度。

(2)麸胱甘过氧化酶(glutathione peroxidaseGPx)活性之分析GPx酵素的活性系使用Cayman Chemical公司生产的分析试剂组(glutathione peroxidase assay kit)测定之,其检测方法简述如下。

        取肝脏细胞,以均质液(50 mmol1 Tris-HC15 retool1 EDTA1 mmoll D'YFpH 75)均质之,在10000 g4℃下离心15分钟。取上清液201~1加入1001~1assay buffer(50 mmolfl Tris-HC15 mmol1 EDTApH76)501xlCO-substrate(1yophilized NADPHglutathioneglutathione reductase)混合后,加入2O Gumenehydroperoxide的溶液开始反应。每分钟以plate reader分析340 nm波长的吸光值并纪录之,最后分析GPx酵素的活性(specific activity)

(3)超氧化物歧化酶(superoxide dismutaseSOD)活性之测定SOD酵素的活性系使用Dojindo Molecular Technologies公司生产的分析试剂组(SOD assay kit-WST)测定之,其检测方法简述如下。

    取肝组织加入适量缓冲液(032 mol1Sucrosel mmolfl EDTA10 nmolfl Tris-HC1pH 74)均质之。以1400g离心5分钟,取上清液,再以4500 g离心1O分钟,下层之沈淀物加入缓冲液测CuZn-SOD(cytosolic SOD),上清液再以11000 g离心60分钟,取沈淀物加入缓冲液分析Mn-SOD (mitochondrial SOD)

    20微升的检体,加入200 Reagent Solution20 EnzymeWorking Solution,于37℃反应20分钟,再读取450 am波长的吸光值并计算SOD的活性。肝组织SOD活性,以每单位蛋白质所含SOD单位量表示(Umg protein)

(4)蛋白质浓度之测定

        实验参照Lowry之方法进行(Lowry et a1.,1951)。取适量蛋白质样品,并以1 N NaOH来调整使其最终体积为100 ml,加入200 ml去离子水及100 ml反应混合液(25Na2CO3 2 Na-K-tartarate 1 CuSO4 = 8 11vvv),然后在室温下静置10分钟,加入1 ml Folin reagent(FolinH20 =1195)后于37℃水浴2O分钟,并在室温下冷却,最后在分光亮度计以660 nm下测其吸光值(25)。然后将标准曲线做线性回归,得一方程式,将所得样品之吸光值代入此一元一次方程式,换算后即可得知样品之蛋白质含量。

15 实验资料统计分析

     所有的数据均以平均值4-标准偏差来表示(mean 4-SD)。不同药物处理的组别以变异数分析(ANOVA)计算,并以Duncan-post-hoc test评估其统计上之差异;P值小于005者表示具有显著的差异。

2结果与结论

21 牛樟芝滴丸对肝功能相关酵素活性的影响

    从西医的角度,当肝脏受到疾病或及他因素导致肝细胞的损伤时,可以由血中的肝功能生化指数上升来进行初步的检测。一般而言,指的就是血液中GPTGOT两种酵素的活性上升。 因此,对于药物或是健康食品是否具有疗效或是保护肝功能的作用,可以由该药物或健康食物是否能回复其肝功能着手(Wonget a1.,2000Hase et a1.,1996)

    负对照组的小鼠经腹腔注射乙酰胺基苯酚(APAP)后,其血清GOTGPT的指数,在处理后的第一周,显著的较正常对照组为高,显示APAP在一周时己对小鼠的肝脏产生损坏,同时,GOTGirl"的指数到实验结束前仍维持显著上升的现象。因此,本项实验动物模式确实为慢性肝损伤动物,可供药物或健康食品进行护肝功效的评估。

    正对照组除注射APAP之外,同时也以口服的方式给予小鼠N一乙酰半胱胺酸(N-acetylcysteineNAC)治疗。与正常对照组相较,处理一到八周的GOTGPT的指数均显著的较高,然而与负对照组相较,则明显的降低。

       

    治疗组的GOTGPT指数,在实验过程中虽显著的较正常对照组为高,然而经口服给予牛樟芝滴丸的治疗后,与负对照组相较,其GOTGPT指数可随着牛樟芝滴丸剂量的增加,呈现剂量相关性的降低。

22 牛樟芝滴丸对小鼠肝脏中各种抗氧化功能相关成份及酵素活性的影响

    机体组织中有一系列有效的抗自由基损伤系统,其中最重要的酵素有超氧化物歧化酶(superoxide dismutaseSOD)SOD是一种金属酶,CuZn&mdash;SOD主要存在于真核细胞的细胞浆内,由两个亚基组成,每个亚基含1个铜和1个锌;Mn-SOD存在于真核细胞的粒腺体,由4个亚基组成,每个亚基各含1个锰;这两种SOD皆能清除体内自由基,减轻自由基对细胞的损伤(Wells eta1.,1997GutteridgeHalliwell2000)

    其它的自由基清道夫(scavenger),如麸胱甘过氧化酶(glutathione pemxidaseGPx)在清除氧自由基也有其重要性(Arthur2000)

    GSH是体内抵抗外来有害物质最强的防御物质(Ketterer1998),而SODGPx清除自由基的能力与酵素活性成正比。小鼠经8周的不同处理后,其肝脏细胞glutathione(GSH)的浓度,以经过APAP处理八周后的负对照组小鼠为最低。

    NAC或牛樟芝滴丸处理后之组别,其GSH浓度则较负对照组显著的提高;同时,牛樟芝滴丸的此项作用并具剂量相关性。经过APAP处理八周后的负对照组小鼠,其肝脏细胞GPx活性显著的较正常对照组为低。

    NAC处理八周后之正对照组小鼠的GPx活性,与正常对照组相较则没有显著差异;而且,也显著的较负对照组为高。小鼠经口服给予牛樟芝滴丸治疗后,与负对照组相较,其GPx活性可随着牛樟芝滴丸剂量的增加,逐渐地恢复;与正常对照组相较无显著异差。

    负对照组小鼠肝脏超氧化歧化酶(SOD)的活性检测结果显示,APAP处理八周后,其SOD的活性,包括铜一锌型SOD (CuZn-SOD)及锰型SOD(Mn-SOD)均较正常对照组为低。

    经过NAC处理八周后的正对照组,小鼠肝脏的两种SOD活性均显著的较负对照组为高。口服牛樟芝滴丸八周后的小鼠,不论是Mn-SOD的活性或是CuZn-SOD的活性皆会随着牛樟芝滴丸剂量的增加而逐渐的提高。

    由此可知,牛樟芝滴丸和NAC具有雷同的效果,能使因被APAP损坏之肝细胞其粒腺体及网状内皮组织系统恢复正常,对于肝功能指数或是抗氧化酶具有回复作用。

    综上所述,由血中肝功能生化指数检测结果显示,大白鼠腹腔注射APAP会升高血中GOTGPT指数,肝脏细胞的GSH浓度也会减少,SODGPx的酵素活性也都下降。牛樟芝滴丸可降低GOTGPT指数,升高GSH浓度,并且可回复SODGPx等相关抗氧化酶的酵素活性的表现,对于保护肝脏功能确有帮助。因此牛樟芝滴丸具有肝脏保护效果。

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