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【試驗】牛樟芝抗肝癌的效應與機制研究

* : * : admin * : 2017-08-16 * : 9

李紅玉

南京中醫藥大學   中醫內科學

  全球每年新確診的惡性腫瘤中約有9.2%為肝癌,在肝癌的新發病例中,亞洲約占70%,其中,我國的肝癌發病率居首位,且我國HCC患者的年死亡人數占全球HCC患者死亡人數的55%左右。那些進展為HCC的患者幾乎都在12個月內死亡,證明HCC進展極快且預後極差,因此,急需尋找有效的治療藥物。

  ANCA-E-D是牛樟芝的二氯甲烷提取物。臺灣當地居民一直用牛樟芝來治療食物和藥物中毒、腹瀉、腹痛、皮膚瘙癢、改善免疫和肝功能等,而現代藥理也證實,牛樟芝具有調節免疫、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化和神經保護等作用。

  研究發現,牛樟芝與中藥靈芝同屬於多孔菌科的真菌,生長習性和性味相近,生物活性成分不同,尤其是牛樟芝的生物活性物質種類比單一種類的靈芝更多,且萜類和多醣等含量更高,故而近年來,牛樟芝的抗腫瘤和免疫調節等功效成為研究的熱點。

  我們認為牛樟芝具有扶正補虛和抗癌解毒的雙重功效,是一種潛在的特異性的抗癌中藥。已有的研究證實,牛樟芝可以抑制肺癌、結腸癌、卵巢癌等多種腫瘤的生長。

  本研究中,我們利用SMMC-7721肝癌細胞株,通過體內和體外實驗,利用基因晶片高通量的特點,初步探討牛樟芝對肝癌細胞的體內外抑制作用和分子機制。

方法:

1.體內實驗

(1)SMMC-7721細胞(4×105 cell/只)接種至46周齡雄性BABL/c裸鼠右後肢皮下,建立裸鼠肝癌皮下移植瘤模型;

(2)造模成功裸鼠隨機分為3組(10/組):生理鹽水對照組,25 mg/kg ANCA-E-D實驗組、50 mg/kg ANCA-E-D實驗組,腹腔注射,每天1次,連續治療21;

(3)觀察裸鼠的一般狀況,測量各組裸鼠的體重、移植瘤體積等;血液學檢測血清ALTAST含量;病理切片HE染色檢測移植瘤和肝腎組織,IHC檢測移植瘤組織的MVDPCNA的表達,TUNEL檢測移植瘤組織的細胞凋亡。

2.體外實驗

(1)020406080 mg/L ANCA-E-D處理SMMC-7721細胞244872hMTT法檢測SMMC-7721細胞的增殖抑制率;

(2)0204060 mg/L ANCA-E-D處理SMMC-7721細胞24hHoechst33258及瑞氏染色觀察細胞形態;

(3)020406080 mg/L ANCA-E-D處理SMMC-7721細胞24h,流式細胞術(FCM)檢測細胞週期和細胞凋亡;

(4)0204060 mg/L ANCA-E-D處理SMMC-7721細胞24h,基因晶片檢測差異基因的表達;

結果:

  體內實驗:ANCA-E-D可抑制裸鼠皮下移植瘤的生長,抑制裸鼠移植瘤中微血管的形成以及PCNA的表達,誘導移植瘤細胞的凋亡;ANCA-E-D對移植瘤裸鼠的ALTAST無影響。

  體外實驗:2080mg/L劑量之間的ANCA-E-D可顯著抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖;Hoechst33258及瑞氏染色發現,ANCA-E-D處理後SMMC-7721細胞出現凋亡形態改變;FCM週期檢測發現,ANCA-E-D可在一定程度上影響SMMC-7721細胞週期進程;FCM凋亡檢測發現,ANCA-E-D處理後,SMMC-7721細胞凋亡呈濃度依賴性增加。基因晶片檢測發現,ANCA-E-D3個劑量組中,共同上調的基因有422個,共同下調的基因有377個。GO功能分析,這些基因涉及細胞信號轉導、遷移、粘附、凋亡、分化、代謝、增殖、血管生成、器官發育等多方面。與凋亡相關的4倍以上的差異基因中,ANCA-E-D20 mg/L組篩選6個,40 mg/L組篩選出12個,60 mg/L組篩選出35個。Pathway分析,3個劑量組中的差異基因均參與的信號通路包括TNF signaling pathwayCalcium signalingpathwayPathways in cancerPI3K-Akt signaling pathwayMAPK signaling pathwayJak-STAT signaling pathway Apoptosis等。

結論:

  牛樟芝提取物ANCA-E-D具有體內外抗肝癌作用,其作用機制可能是通過影響EDNRAHRKLCN2ANGPTL4等基因的表達,進而影響包括凋亡在內的諸多信號通路來實現的。