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【試驗】牛樟椴木栽培之牛樟芝子實體的大鼠 90 天重複劑量亞慢性毒性評估(上)

* : * : admin * : 2017-08-18 * : 143

【試驗】牛樟椴木栽培之牛樟芝子實體的大鼠 90 天重複劑量亞慢性毒性評估(上)


王志源,楊長青,王千眉,蔡慶龍,蔡嶽廷

新北市,臺灣

檢驗及品保雜誌(J Testing Qual Assur) 2016; 5:  99~110

摘要

  本試驗系依據衛生署公告之健康食品安全性評估方法,評估牛樟椴木栽培之牛樟芝子實體萃取物,經連續餵食大鼠90 天后對大鼠體內可能產生之毒性變化進行評估,以作為重複使用安全性的參考。

  本試驗共設置4 組試驗組,分別為對照組、低、中及高劑量組。低、中及高劑量組試驗物質投予劑量分別為50 mg/kg B.W.100 mg/kg B.W.150 mg/kg B.W.,分別為人體每日建議口服劑量(人體每日3060 90mg/60Kg B.W.)之100 倍。每組各使用10 隻雄性及雌性Sprague-Dawley (SD) 品系大鼠,以口服管喂方式連續90 天投予試驗物質,每日進行試驗動物之臨床觀察,且每週測量試驗動物之體重及攝食量。

  試驗結束後,犧牲大鼠採集血液及臟器進行血液學分析、血清生化分析及病理學檢查。

前言

         1999 年行政院衛生署食字第88037803號公告健康食品安全性評估方法[10]。依此方法,此試驗目的系評估試驗物質「牛樟芝子實體(牛樟椴木栽培)」經重複給予90 天后對哺乳類動物可能產生之毒性影響,瞭解毒性變化之產生,同時測定無毒性顯示之劑量(noobserved-adverse-effect level, NOAEL)

材料及方法

實驗動物及飼養環境

        試驗動物為5 周齡之雄性與雌性Sprague–Dawley (SD) 品系大鼠各40 只,共80 只。經由樂斯科生物科技股份有限公司購入,入室後經7 天檢疫期以及7 天適應期,試驗開始時大鼠為7 周齡。飼養於通過TFDA-GLPOECD-GLP 認證的台美實驗動物中心,22±3℃、55±15%相對濕度、12 小時之光暗週期,以及充分提供經滅菌之逆滲透水。

分組與劑量

        大鼠90 天重複劑量亞慢性毒性試驗,共使用80 只大鼠,試驗物質有低、中及高劑量,加上對照組共4 組,每組雌雄各10 只大鼠。5 週齡之雄性SD大鼠經檢疫馴養二星期後至7 周齡時開始進行試驗,動物隨機分成4 組,每籠兩隻,並編號打耳洞表示。

        劑量選定,根據試驗委託單位所提供資料顯示,「牛樟椴木栽培牛樟芝子實體(Fruiting body of Antrodia cinnamomea)」成人每日攝取量為3060 90 mg/60Kg B.W. 大鼠給予劑量分別為50 mg/kg B.W.100 mg/kg B.W.150 mg/kg B.W.,一天一次喂足,為人體每日建議口服劑量之100 倍。詳細分組如下表1 所示:

檢測項目

        臨床症狀觀察:試驗期間每日進行臨床觀察,並記錄投予試驗物質後試驗大鼠是否顯現異常臨床症狀或死亡情形,所有異常臨床症狀或死亡情形均須記錄於個別動物臨床觀察紀錄表。

        眼睛檢查:先以肉眼觀察有無外觀之異常,再使用檢眼鏡(Ophthalmoscope) 檢查眼睛內部構造。所有動物在試驗開始前及試驗結束犧牲前一日均須進行眼睛檢查。體重與攝食量測定:試驗期間每週測量各組大鼠體重1 次。攝食量每週進行結算1次,量測方法為體重稱重當日加入定量飼料,一週後結算剩餘飼料量。

       尿液分析:於犧牲前一日,將動物置於代謝籠內約16 小時並收集尿液。利用尿液檢測分析儀(PU-4010ARKRAY Core Laboratory,日本)分析各組大鼠尿液之比重(specific gravitySG)、顏色(color)、蛋白質(protein)、尿膽素原(urobilinogen)、酸鹼值(pH)、酮體(ketone body)、膽紅素(bilirubin)、葡萄糖(glucose)、亞硝酸鹽(nitrite)及潛血(occult blood)反應。將尿液離心後取尿沉渣以顯微鏡檢查其中所含白血球計數(whiteblood cell countWBC)、紅血球計數(redblood cell countRBC)及上皮細胞(epithelialcellEP) 等細胞種類與數目、尿結晶(crystals)種類與數目及微生物數目數目等。

        血液學分析:試驗動物於犧牲前經隔夜禁食,以二氧化碳麻醉後經心臟採集血液。血液置於含有EDTA 抗凝劑之收集管中於室溫下混合均勻, 以全自動血球分析儀(XE-1800iSysmex,日本)進行以下項目之檢測:血球容積比(hematocrit)、血紅素量(hemoglobin)、紅血球數(RBC)、白血球數(WBC)、血小板數(platelet count)、平均紅血球容積(mean corpuscular volumeMCV)、平均紅血球血紅素(mean corpuscular hemoglobinMCH)、平均紅血球血紅素濃度(meancorpuscular hemoglobin concentrationMCHC)、淋巴球(lymphocyte)、嗜中性球(neutrophil) 及單核球(monocyte) 、嗜酸性球(eosinophil) 以及嗜鹼性球(basophil)此五種白血球百分比。另以含有sodium citrate 抗凝劑之收集管採集血液並以全自動血液凝固分析儀(CA-1500Sysmex,日本)檢測凝血酶原時間(prothrombin time)

        血清生化分析:動物經隔夜禁食,以二氧化碳麻醉後經心臟進行血液採樣。血液靜置於室溫待其凝固後,離心分離出血清並以血清生化分析儀(7070 AutoanalyzerHitachi,日本)進行以下項目之檢測:鹼性磷酸酶(alkaline

phosphataseALP)、麩氨酸氨基轉氨酶(aspartate aminotransferaseAST)、麩氨酸丙酸轉氨酶(alanine aminotransferaseALT)、丙麩氨轉肽酶(Gamma-glutamyl transpeptidase-GT)、白蛋白(albumin)、球蛋白(globulin)、血總蛋白質(total protein)、總膽紅素(total bilirubin)、肌酸酐(creatinine)、血中尿素氮(blood urea nitrogenBUN)、葡萄糖(glucose)、膽固醇(cholesterol)、三酸甘油酯(triglyceride)、磷離子(phosphorus)、鈣離子(calcium)、氯離子(chloride)、鉀離子(potassium)及鈉離子(sodium)

        組織病理學檢查:試驗期間,若有動物死亡均儘快進行解剖檢查。試驗結束後(試驗第91 天)所有存活大鼠,以二氧化碳麻醉後經心臟採血犧牲,並進行解剖,以肉眼檢查大鼠外觀、口腔、顱腔及胸、腹腔內所有組織及器官,並將檢查結果記錄於解剖紀錄表上。採集各試驗組之腦(brain)、心臟(heart)、腎臟(kidney)、肝臟(liver)、脾臟(spleen)、腎上腺(adrenals)、睾丸(testis)或卵巢(ovary)、胸主動脈(aorta)、骨髓(bone marrow)、十二指腸(duodenum)、空腸(jejunum)、迴腸(ileum)、盲腸(caecum)、結腸(colon)、直腸(rectum)、眼睛(eyes)、食道(esophagus)、乳腺(mamary gland)、哈氏腺(Harderian gland)、氣管(trachea)、肺(lung)、淋巴結(lymphnode)、胰臟(pancreas)、坐骨神經(sciaticnerve)、腦下垂體(pituitary)、前列腺(prostategland)、唾液腺(salivary gland)、皮膚(skin)、脊椎(spinal cord)、胃(stomach)、肌肉(thighmuscle)、胸腺(thymus)、甲狀腺/副甲狀腺(thyroid/parathyroid gland)、膀胱(urinarybladder)、子宮(uterus)等組織,並將上述組織以10 %中性福馬林溶液進行固定及保存(各組大鼠睾丸則以modified Davidson’s solution固定24 小時後,再以10%中性福馬林溶液保存)。取下所有存活大鼠的主要器官:腦、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、腎上腺、睾丸或卵巢,去除週邊脂肪組織後分別稱重及記錄其絕對重量。另計算各臟器與體重(試驗第91 天) 之比值(organ weight relativebody weight ratios),即臟器相對重量比率(%)=臟器重量(g)÷體重(g)×100%。組織病理檢查主要將所有上述固定好的組織樣本經石包埋、切成6~5 m 厚度之薄片,以蘇木紫和伊紅染色(hematoxylin and eosinstain),並使用光學顯微鏡觀察,分析各臟器之組織病理變化。

資料整理與分析

        實驗資料以平均值(mean)及標準差(standarddeviation, S.D.)表示。動物之體重、攝食量、臟器重量、血液學分析及血清生化分析等資料,均利用SPSS 統計軟體中單因數變異數分析(One-Way ANOVA) Duncan’smultiple range test 分析各組別間資料之差異性,並以p 值小於0.05 作為顯著差異水準。